IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) o se faʻataʻitaʻiga o le substrate β-galactosidase, lea e sili ona faʻaogaina.I lalo o le induction o le IPTG, e mafai e le inducer ona fausia se faʻalavelave faʻatasi ma le protein repressor, ina ia suia le conformation o le protein repressor, ina ia le mafai ona tuʻufaʻatasia ma le kenera taulaʻi, ma faʻaalia lelei le kenera taulaʻi.E faʻafefea la ona faʻamautinoa le faʻatonuga o le IPTG i le taimi o le suʻega?E sili atu le tele?
Muamua, sei o tatou malamalama i le mataupu faavae o le IPTG induction: E. coli's lactose operon (elemene) o loʻo i ai ni kenera faʻavae e tolu, Z, Y, ma A, lea e faʻaogaina ai le β-galactosidase, permease, ma le acetyltransferase.LacZ fa'asusu le lactose i le kulukose ma le galactose, po'o le allo-lactose;lacY fa'atagaina le lactose i totonu o le si'osi'omaga e ui atu i totonu o le sela sela ma ulu atu i le sela;lacA fa'aliliuina le vaega acetyl mai le acetyl-CoA i le β-galactoside, lea e aofia ai le aveesea o aafiaga Toxic.E le gata i lea, o loʻo i ai se faʻasologa o loʻo galue O, o se faʻasologa amata P ma se faʻatonuga faʻatonuga I. O le I gene code o se polotini repressor e mafai ona fusifusia i le tulaga O o le faʻasologa o le operator, ina ia taofiofia le operon (meta) ma tapeina.O loʻo iai foʻi se nofoaga faʻapipiʻi mo catabolic gene activator protein-CAP binding site upstream of the initiating sequence P. O le P sequence, O sequence ma le CAP binding site o loʻo i ai le vaega faʻatonutonu o le lac operon.O genes coding o enzymes e tolu o loʻo faʻatulafonoina e le itulagi faʻatulafonoina tutusa e ausia ai le faʻamaopoopoina o faʻamatalaga o gene oloa.
I le leai o le lactose, o le lac operon (meta) o loʻo i ai i se tulaga o le taofiofia.I le taimi nei, o le lac repressor o loʻo faʻaalia e le I sequence i lalo o le pule a le PI promoter sequence e fusifusia i le O sequence, lea e taofia ai le RNA polymerase mai le fusia o le P sequence ma faʻalavelaveina le amataina o tusitusiga;pe a iai le lactose, e mafai ona fa'aoso le lac operon (meta) I totonu o lenei faiga o le operon (meta), o le fa'aoso moni e le o le lactose lava ia.Lactose e ulufale i totonu o le sela ma faʻapipiʻiina e le β-galactosidase e liua i le allolactose.O le mea mulimuli, e pei o se mole faʻaosoina, e fusifusia i le polotini repressor ma suia le faʻasologa o le porotini, lea e oʻo atu ai i le vavaeeseina o le polotini repressor mai le faasologa O ma le faʻaliliuga.Isopropylthiogalactoside (IPTG) e tutusa lona aafiaga ma le allolactose.O se mea e sili ona mamana, e le faʻafefeteina e siama ma e matua mautu, o lea e faʻaaogaina lautele i fale suʻesuʻe.
E faʻapefea ona fuafua le faʻatonuga sili ona lelei o le IPTG?Ave le E. coli o se faʻataʻitaʻiga.
O le E. coli BL21 genetically engineered strain o loʻo i ai le pGEX recombinant lelei (CGRP / msCT) na tui i totonu o le LB vai ala o loʻo i ai le 50μg·mL-1 Amp, ma faʻatupuina i le po i le 37 ° C.O le aganuu o loʻo i luga na faʻapipiʻiina i totonu o fagu 10 o 50mL fou LB faʻafefe vai o loʻo i ai le 50μg · mL-1 Amp i le fua faatatau o le 1: 100 mo le faʻalauteleina o aganuu, ma pe a oʻo i le tau OD600 0.6 ~ 0.8, na faʻaopoopoina IPTG i le faʻatonuga mulimuli.E 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Ina ua uma le induction i le vevela tutusa ma le taimi lava e tasi, 1 mL o le vaifofo siama na ave mai ai, ma o siama siama na aoina e centrifugation ma tuuina atu i le SDS-PAGE e suʻesuʻe ai le aafiaga o le eseese IPTG concentrations i luga o le protein expression, ona filifili le fa'atonuga IPTG fa'atasi ai ma le fa'amatalaga sili ona tele o porotini.
A maeʻa faʻataʻitaʻiga, o le a maua ai o le faʻatonuga o le IPTG e le tele pe a mafai.E mafua ona o le IPTG e iai se faʻamaʻi oona i siama.O le sili atu i le faʻatonuga o le a faʻaumatia ai foi le sela;ma e masani ona tautala, matou te faʻamoemoe o le sili atu o le soluble protein o loʻo faʻaalia i totonu o le sela, o le sili atu lea, ae i le tele o tulaga pe a maualuga tele le faʻaogaina o le IPTG, o le a fausia se aofaiga tele o le aofia.Tino, ae o le aofaʻi o porotini solu na faʻaitiitia.O le mea lea, o le faʻaogaina o le IPTG sili ona talafeagai e masani lava e le sili atu le sili atu, ae o le maualalo o le faʻatonuga.
O le fa'amoemoega o le fa'aulufaleina ma le fa'atupuina o fa'ainisinia fa'ainisinia o le fa'atuputeleina lea o le fua o le porotini fa'atatau ma fa'aitiitia le tau.O le faʻaaliga o le kenera taulaʻi e le gata ina aʻafia i aʻafiaga a le tagata lava ia ma le faʻaaliga plasmid, ae faʻapea foʻi ma isi tulaga i fafo, e pei o le faʻaogaina o le faʻaosoina, le vevela o le induction ma le taimi faʻapipiʻi.O le mea lea, i se tulaga lautele, aʻo leʻi faʻaalia ma faʻamamāina se polotini le iloa, e sili ona lelei le suʻesuʻeina o le taimi faʻaulu, vevela ma le faʻaogaina o le IPTG ina ia mafai ai ona filifili tulaga talafeagai ma maua ai faʻataʻitaʻiga sili ona lelei.
Taimi meli: Tes-31-2021