O le IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) o se analogue o le β-galactosidase substrate, lea e matua faigofie lava ona fa'aosofia. I lalo o le fa'aosofia o le IPTG, e mafai e le inducer ona fausia se complex ma le repressor protein, ina ia suia ai le conformation o le repressor protein, ina ia le mafai ai ona tu'ufa'atasia ma le target gene, ma fa'aalia lelei ai le target gene. O lea la, e fa'apefea ona fuafua le concentration o le IPTG i le taimi o le fa'ata'ita'iga? Pe o le tele ea o le lelei?
Muamua, se'i o tatou malamalama i le mataupu faavae o le fa'aosofiaga o le IPTG: O le lactose operon (elemene) a le E. coli o lo'o i ai ni kenera fa'atulagaina se tolu, Z,Y, ma le A, lea e fa'ailoa ai le β-galactosidase, permease, ma le acetyltransferase. E fa'a'asu'i e le lacZ le lactose i le glucose ma le galactose, po'o le allo-lactose; e fa'atagaina e le lacY le lactose i le siosiomaga e ui atu i le membrane o le sela ma ulufale atu i le sela; e fa'aliliuina e le lacA le vaega acetyl mai le acetyl-CoA i le β-galactoside, lea e aofia ai le ave'esea o le aafiaga oona. E le gata i lea, e iai se fa'asologa o galuega O, se fa'asologa amata P ma se kenera fa'atonutonu I. O le kenera I o se porotini taofia e mafai ona fusifusia i le tulaga O o le fa'asologa o le operator, ina ia taofia ma tape le operon (meta). E iai fo'i se nofoaga e fusifusia ai le nofoaga e fusifusia ai le catabolic gene activator protein-CAP i luga a'e o le fa'asologa amata P. O le fa'asologa P, fa'asologa O ma le nofoaga e fusifusia ai le CAP fa'atasi e fausia ai le itulagi fa'atonutonu o le lac operon. O genes o lo'o fa'ailoa mai ai le igoa o enzymes e tolu e fa'atonutonuina e le itulagi fa'atonutonu e tasi ina ia ausia ai le fa'aalia fa'atasi o oloa o gene.
A leai se lactose, o le lac operon (meta) o loʻo i ai i se tulaga o le taofiofia. I le taimi nei, o le lac repressor o loʻo faʻaalia e le faʻasologa I i lalo o le pulea o le faʻasologa o le PI promoter e fusifusia i le faʻasologa O, lea e taofia ai le RNA polymerase mai le fusifusia i le faʻasologa P ma taofia ai le amataina o le transcription; pe a iai le lactose, e mafai ona faʻaosofia le lac operon (meta). I totonu o lenei faiga operon (meta), o le faʻaosofia moni e le o le lactose lava ia. E ulufale le lactose i totonu o le sela ma faʻagaoioia e le β-galactosidase e liua i le allolactose. O le mea mulimuli, i le avea ai ma se mole mole faʻaosofia, e fusifusia i le porotini faʻaosofia ma suia le fausaga o le porotini, lea e oʻo atu ai i le vavaeʻeseina o le porotini faʻaosofia mai le faʻasologa O ma le transcription. O le Isopropylthiogalactoside (IPTG) e tutusa lona aafiaga ma le allolactose. O se faʻaosofia malosi tele, e le faʻaleagaina e siama ma e matua mautu lava, o lea e faʻaaogaina lautele i fale suʻesuʻe.
E fa'apefea ona fuafua le maualuga lelei o le IPTG? Se'i fai ma fa'ata'ita'iga le E. coli.
O le ituaiga E. coli BL21 ua fa'ainisinia fa'akeneka o lo'o i ai le pGEX recombinant lelei (CGRP/msCT) na fa'asusuina i totonu o le vai fa'asusu LB o lo'o i ai le 50μg·mL-1 Amp, ma fa'atupuina i le po atoa i le 37°C. O le fa'atupuina o lo'o i luga na fa'asusuina i totonu o fagu e 10 o le vai fa'asusu LB fou e 50mL o lo'o i ai le 50μg·mL-1 Amp i le fua fa'atatau o le 1:100 mo le fa'atupuina o le fa'alauteleina, ma ina ua 0.6~0.8 le tau o le OD600, ona fa'aopoopo lea o le IPTG i le fa'aputuga mulimuli. O le 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. A maeʻa ona faʻaosoina i le vevela tutusa ma le taimi tutusa, ona aveese lea o le 1 mL o le vailaʻau siama mai ai, ma aoina sela siama e ala i le centrifugation ma faʻatinoina i le SDS-PAGE e iloilo ai le aafiaga o le eseesega o le IPTG i le faʻaalia o le porotini, ona filifili lea o le IPTG e sili ona tele le faʻaalia o le porotini.
A maeʻa faʻataʻitaʻiga, o le a iloa ai o le maualuga o le IPTG e le o tele e mafai ai. E mafua ona o le IPTG e iai sona aafiaga oona i siama. O le sili atu i le maualuga o le a fasiotia ai foʻi le sela; ma i se tulaga lautele, matou te faʻamoemoe o le tele o porotini soluble o loʻo faʻaalia i totonu o le sela, o le lelei lea, ae i le tele o tulaga pe a maualuga tele le maualuga o le IPTG, o le a tele ai le aofia ai. Tino, ae o le aofaʻi o porotini soluble e faʻaitiitia. O le mea lea, o le maualuga sili ona talafeagai o le IPTG e masani lava e le o le tele o le lelei, ae o le maualalo o le maualuga.
O le fa'amoemoega o le fa'aosofia ma le totoina o ituaiga ua fa'ainisinia fa'akenekaresi o le fa'ateleina lea o le fua o le porotini fa'amoemoe ma fa'aitiitia ai tau. O le fa'aalia o le kene fa'amoemoe e le gata ina a'afia e mea taua a le ituaiga ma le fa'aalia o le plasmid, ae fa'apea fo'i ma isi tulaga i fafo, e pei o le malosi o le mea e fa'aosofia ai, le vevela o le fa'aosofia ma le taimi o le fa'aosofia. O le mea lea, i se tulaga lautele, a'o le'i fa'aalia ma fa'amamāina se porotini e le o iloa, e sili ona su'esu'e le taimi o le fa'aosofia, le vevela ma le malosi o le IPTG ina ia mafai ai ona filifili tulaga talafeagai ma maua ai taunu'uga sili ona lelei o fa'ata'ita'iga.
Taimi na lafoina ai: Tesema-31-2021